ISOLASI DNA TUMBUHAN

Advertisement

Advertisement

ISOLASI DNA TUMBUHAN

LAPORAN

Oleh :

MALEK AZIS

1408104010002

isolasi tomat

JURUSAN BIOLOGI

LABORATORIUM BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SYIAH KUALA

DARUSSALAM, BANDA ACEH

MARET, 2016

BAB I

PENDAHULUAN

1.      Latar Belakang

Isolasi DNAmerupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah ( Istanti, Annie. 1999).

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen (Suryo, 2004).          

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon ( Murray,2009).

2.      Tujuan Pratikum

 Adapun tujuan yang akan dicapai pada percobaan isolasi DNA ini yaitu untuk mengetahui cara memisahkan (mengisolasi) DNA dari 2 jenis buah yang dijadikan sebagai sampel, serta untuk mengetahui keaktifan detergen dalam proses isolasi DNA pada sampel buah.

BABII
TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak (Yuwono, 2008).

Pada sel eukariotik termasuk tanaman dan hewan bagian terbesar dari DNA berada pada nukleus yaitu organel yang dipisahkan dari sitoplasma dengan membran. Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai pemanenan sel. Dimana metode tersebut merupakan bagian  dari metode isolasi DNA (Elrod, 2007).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert, 1994).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA ( Istanti, Annie. 1999).

Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit ( Murray,2009).

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia ( Murray,2009).

  Prinsip – prinsip dalam mengisolasi DNA ( Solomon, 2002).

1. melisis sel secara fisik, dengan cara penggerusan.
2. pemecahan dinding sel.
3. pemecahan membran sel.
4. pemisahan DNA dari bahan yang lain.

            Dalam isolasi DNA, bahan yang kita gunakan biasanya berupa jaringan tumbuhan atau jaringan hewan, untuk itu langkah pertama yang harus kita lakukan adalah memecahkan jaringan menjadi sel-sel yang mandiri. Proses dilakukan secara mekanik atau fisik dengan menumbuk atau menggerus bahan yang akan kita gunakan dengan mortar atau blender. Kedua adalah memecahkan dinding sel dan membran sel lapisan pembungkus DNA. struktur utama pembentuk membran dan dinding sel adalah lemak, untuk itu kita gunakan deterjen dan garam dapur. Kedua bahan ini digunakan untuk melubangi dan merusak sel sehingga isi inti sel (DNA) bisa keluar ( Solomon, 2002).

Tahap selanjutnya adalah pemisahan DNA dari bahan yang lain. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan ethanol/alkohol dingin berkonsentrasi 90-95%. Ethanol/Alkohol tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik dan melayang-layang di permukaan ( Solomon, 2002).

CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel ( Solomon, 2002).

Klorofrom dan isoamilalkohol (CIAA) berfungsi untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA. Pemberian isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi. Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak. Dalam buffer TE mengandung EDTA atauEthylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA tergantung bahan yang diekstraksi (Asris, 2010).

Metode ini tidak membutuhkan biaya yang lebih mahal dibandingkan dengan menggunakan kit. Selain itu, kelebihan dari ektraksi ini adalah pita DNA yangdiproleh lebih tebal bila dibandinglan dengan ektraksi metode fenol dan tanpa fenol. Akan tetapi, dari hasil dengan metode ini masih terdapat pita smear dan DNA yang dihasilkan lebih sedikit daripada ektraksi dengan menggunakan kit. Kendala yang umum terjadi dalam ekstraksi CTAB adalah adanya inhibitor pada inang, rendahnya konsentrasi vius dan pengaruh cara maupun lama waktu penyimpanan (Asris, 2010).

BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1. Alat dan Bahan

2.1. Alat

Alat – alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah alat tulis menulis, gelas beaker, gelas ukur,saring, batang pengaduk,sendok, dan plastic tip.

2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah buah tomat Solanum lycopercium Pisang, detergen (Sunlight), Aquades, garam dapur, dan Alkohol 70%.

3.2 Cara Kerja

Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut:

1.      Mencampurkan 10 mL deterjen/Sunligtht dengan 90 mL Aquadest steril dan ditambahkan garam secukupnya di dalam gelas kimia, kemudian di aduk sampai pecah semuanya rata.

2.      Menambahkan tomat/pisang dan larutan yang telah dibuat ke dalam plastic klip.

3.      Menhancurkan tomat/pisang didalam plastic klip setelah dikeluarkan udara dari plastic klip.

4.      Kemudian disaring larutan ke dalam gelas kimia dengan peralahan-lahan.

5.      Aliri Alkohol 70% melalui dinding gelas kimia dengan perlahan-lahan.

6.     Mengunggubeberapa saat sehingga DNA mengapung.

BAB IV

DATA HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Data hasil pengamatan

 Data hasil pengamatan terlampir di lampiran

4.2 Pembahasan

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta

pemurnian DNA. Dalam percobaan ini, kami melakukan isolasi DNA yang berasal dari 2 jenis buah yang memiliki kandungan air yang berbeda. Tujuan dari percobaan ini adalah

untuk mengisolasi atau memisahkan DNA yang berasal dari tumbuhan. Metode yang

dilakukan dalam percobaan ini adalah penghancuran (lisis) serta ekstraksi. Perlakuan pertama yang diberikan pada buah yaitu mengupas serta memotongnya menajadi ukuran yang lebih kecil, hal ini dilakukan agar pada saat penghancuran buah mudah dihancurkan menjadi partikel – partikel yang lebih kecil. Tahap selanjutnya yaitu menambahkan campuran detergen dengan air, hal ini bertujuan untuk merusak membran sel dari kedua buah tersebut. Perusakan membran sel terjadi akibat adanya ikatan kimia yang terbentuk antara detergen dengan zat-zat yang ada pada buah. Setelah penambahan detergen tahap selanjutnya yaitu penambahana garam dapur sebanyak 1 spatula ke masing-masing tabung yang berisi campuran buah dan detergen, tujuan dari penambahan garam adalah untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari campuran sehingga benang-benang tersebut akan mudah diamati. Hal ini terjadi karena Na⁺ dalam garam dapat membentuk ikatan pada kutub negative dari ikatan fosfat DNA.Setelah larutan ditambahkan garam larutan kemudian dihomogenkan.

             Tahap selanjutnya yaitu penambahan Alkohol 70%, penambahan ini bertujuan untuk mempermudah terjadinya presipitasi pada benang-benang DNA alcohol tersebut mampu membawa asam nukleat yang terdapat dalam campuran naik ke permukaan, untuk kemudian diendapkan.

              Dari percobaan isolasi DNA diperoleh hasil yaitu, perbedaan warna pada masing-masing tabung reaksi yang berisi campuran buah, detergen, garam, dan alcohol. Perubahan warna yang terjadi diakibatkan oleh perbedaan susunan DNA yang terdapat pada setiap buah. Selain itu perbedaan yang mencolok dari larutan tersebut adalah terdapat banyak atau sedikit endapan asam nukleat pada dasar tabung reaksi. Hal ini terjadi akibat adanya perbedaan kandungan zat serta penggunaan jenis detergen yang berbeda maupun kandungan air dari masing-masing buah tidak sama. Dari percobaan tidak diperoleh DNA murni melainkan hanya DNA kasar atau benang – benang halus (supernatant) dalam jumlah yang sedikit serta endapan putih yang terlihat. Dari kedua buah DNA kasar yang paling terlihat ada pada buah pisang, hal itu terjadi akibat kandungan air pisang lebih sedikit dari tomat sehingga ekstrak dan DNA kasar yang dihasilkan oleh pisang lebih banyak daripada buah tomat, selain itu endapan putih pada buah pisang lebih banyak daripada buah tomat.

BAB V

PENUTUP

5. Kesimpulan

Dari percobaan isolasi DNA yang telah dilakukan dapat diketahui metode atau cara bagaimana mengisolasi DNA dari buah yang dijadikan sebagai sampel. Yaitu melalu cara penghancuran (lisis), ekstraksi, serta pemurnian. Penggunaan detergen dalam percobaan dilakukan untuk menghancurkan membran sel pada setiap sampel buah.Setelah dilakukan percobaan ternyata buah pisang lebih banyak menhasilkan DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., 1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Asris., 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.UGM.

Elrod, S., 2007. Genetika Edisi Keempat. Erlangga. Jakarta.

Murray, Robert K.2009.Biokimia Harper.Jakarta:EGC

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.

Suryo, 2004. Genetika Strata 1. Universitas Gadjah Mada. Yogyakarta.

Solomon, E.P, Berg, L.R, Martin, D.W. 2002. Biology. 6th Ed. Brooks/Cole Thompson Learning. USA.

Yuwono, T., 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.

LAMPIRAN

isolasi pisang

isolasi tomat

admin

Driver HP HP Desktop driver program, Your site is very good, have a very clear explanation, I love visiting your site, you need an hp printer driver, please download it on our page ,, good luck ,,

Subscribe to receive free email updates: